참고 - 본인은 실험실 생활 약 6개월이 되어가는 학부 연구생이나 아는 게 없음.
따라서 본인이 알기 쉽게 여러 기본적인 실험에 대해서 정리한 것. 틀린 부분이 있다면 미리 심심한 사과를 전합니다.
아는 건 없고, 궁금한 건 많아서 하나하나 태클 걸 듯이 정리했습니다 = ADHD적인 면모가 많은 글. 딱히 읽는 걸 추천하지 않습니다.
단백질 정량은, sample(시료) 내에 protein이 얼마나 있는지, 그 농도를 구하고자 하는 방법임
크게 여러 가지 방법으로 나뉘는데, 크게 Colorimeteric Assay(비색법), Fluorometeric Assay (형광법), Absorbance-based method(흡광도 측정법) 등이 있다.
(실험원리별로 분류한 것이며, 다른 기준으로는 비색법-전기영동법 두가지로 나누기도 한다.)
주로 실험실에서 사용하는 방법은 Colorimeteric assay로, 그 안에서도 Bradford assay, BCA (Bicinchoninic acid) assay를 보편적으로 사용한다. 본편에서는 Bradford assay를 먼저 다루기로 했다.
※ Colorimeteric assay (비색법)
발색 시약을 이용하여 빛의 특정 파장 흡광도를 선택 및 측정해 단백질의 농도를 확인(정량)하는 방법.
단백질과 특정 시약이 반응하여 색이 변하는 원리를 이용한다.
※ Bradford assay
Coomassie Brilliant Blue G-250 라고 하는 염료와 단백질이 결합하면서 발생하는 색 변화를 이용하는 방법이다
(여담이지만, Bradford라는 과학자가 개발한 방법이라고 한다 ㅋㅋ 자기 이름 붙이는 건 과학자들 특인가보다..)
▲ Coomassie Brilliant Blue G-250 : 주로 단백질 염색 및 정량에 사용되는 aniline-based Dye (Bradford 외에도 SDS-PAGE protein 염색에도 활용됨) (aniline = 아민기를 가지 염기성 물질임)
| 특성 | 설명 |
| 분자식 | C₄₅H₄₄N₃NaO₇S₂ |
| 분자량 | 854.02 g/mol |
| 용해 O | Methanol, Ethanol, DMSO, Acetic acid, Phosphoric acid, Hydrochloric acid 등 |
| 용해 X or 부분적 | 물, 알칼리 용액 / 아세톤에서는 일부 용해 |
| pH에 따른 색 변화 | 산성(pH 1~2) : 적색 중성(pH 7) : 녹색 단백질과 결합 시 : 청 |
| 흡광 최대 파장 | 595 nm (단백질과 결합시) |
| 단백질과 결합 방식 | 비공유 결합(Hydrophobic & Electrostatic) 주로 Arg, Lys, His, Trp, Tyr과 같은 염기성 & 방향족 Amino acid와 결합 |
(Bradford assay와 관련된 특성만 기입)
★ Bradford assay의 장점
- 빠르고 간단 : 시약과 샘플을 섞으면 끝. 10~15분 이내에 결과 확인이 가능하다
- 민감함 : 1-20 μg의 범위의 단백질도 정량이 가능하다
- 대중적인 실험기기 사용 : 대부분의 실험실에서 보유하는 Spectrophotometer나 Microplate reader를 사용한다.
- 샘플의 상태 : 단백질이 buffer에 녹아 있든 이온, 환원제 등이 있는 용액에 녹은 상태에서도 사용 가능함
- 실험 환경 : 상온에서 진행할 수 있다.
★ Bradford assay의 단점
- detergent와의 상호작용 : sample에 detergent가 있는 경우에는 정확한 측정이 어려움
- 측정 농도의 제한 : 측정 농도가 한정적이기 때문에 너무 높거나 낮으면 신뢰성 떵러짐
- standard protein의 선택 : 보통은 BSA(Bovine Serum Albumin)을 사용하나 sample의 단백질이 다른 성질을 가지면 편차가 생김
- 산성 조건 : 단백질이 염기성 용액에 녹아 있거나, 산성에서 잘 녹지 않은 단백질을 정량할 경우 측정이 어려움
★ 실험 준비
Bradford 용액, microreader(우리 랩실에서는 이걸로 함), BSA, sample protein, vortex, tube
- Bradford 용액 : Coomassie Brilliant Blue G-250 100mg을 95% ethanol 50mL에 녹이고, 85% phosphoric acid(H₃PO₄ )100mL와 섞은 후 1L(DI water)로 희석한다 -> Whatman filter 로 filtering하면 끝 (보관은 갈색 병 + 알루미늄 호일로 가둬서 냉장 보관)
★ 실험 방법
○ standard curve 만들기
- BSA를 1mg/mL의 농도가 되도록 DI water에 녹인다. (0.001g을 재서 1mL에 녹였음)
- 1번의 BSA 용액을 Serial dilution을 진행한다.
3. Sample을 준비
4. 96 well plate에 Bradford 용액 : BSA sample = 50 : 50으로 해서 넣어준다
5. microreader로, 파장 595nm을 설정해서 kinetic으로 측정한다 (cycle은 1분)
나는 kinetic으로 1분당 1번 촬영하는 방식을 사용했는데, 10분 반응 시킨 후 endpoint로 촬영하는 경우도 있다.
흐음 .... 잘 모르겠다~!